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T細胞亞群試劑盒如何使用,操作過程詳解

更新時間:2020-06-16      瀏覽次數(shù):1965

T細胞亞群試劑盒如何使用,操作過程詳解

上海信帆生物供應(yīng)T細胞亞群測試盒,產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定,庫存充足,深受廣大科研用戶青睞!

T細胞亞群檢測試劑盒說明書

 

一:試劑盒組成:

1.

防脫片劑

2ml

2.

固定液

10ml

3.

A小鼠抗人CD3單抗

1ml

 

B小鼠抗人CD4單抗

1ml

 

C小鼠抗人CD8單抗

1ml

4.

生物素標記羊抗小鼠IgG( IgG/Bio)

3ml

5.

堿性磷酸酶標記鏈霉卵白素(S-A/AP)

3ml

6.

A底物增強劑(40×)

200μl

 

B底物液(40×)

200μl

 

C底物緩沖液(10×)

800μl

7.

細胞核復染液

5ml

8.

封片劑

1ml

9.

記號筆

1支

10.

PBS

2包(1000ml)

 

二:標本制備:

 

取肝素抗凝(25μl/ml)的靜脈血1~2ml,PBS稀釋1-2倍后,沿裝有等量淋巴細胞分離液的試管壁混勻緩慢加至液面上層,保持兩種液體界面清晰,離心(2000轉(zhuǎn)/分)15-20分鐘,吸取兩液面交界處的單個核細胞層,加5倍PBS,離心(1000轉(zhuǎn)/分)5分鐘,棄上清液,沉淀即為單個核細胞。利用試管中剩余的少許回流液體(約一滴)混勻細胞,制成單個核細胞懸液。滴30μl細胞懸液于載玻片上,靜置2分鐘使細胞下沉粘附于玻片上,吸去液體,快速吹干或37℃溫箱1小時烤干?;蛴肞BS將單個核細胞調(diào)至2×105個/ml,離心涂片機1000轉(zhuǎn)離心1-2分鐘制片,快速吹干或37℃溫箱1小時烤干。涂片前取防脫片劑5-10μl均勻推片,亦可用棉簽粘取防脫片劑均勻涂于干凈玻片上,待干后制備細胞涂片,以防掉片。

 

三:顯色劑的配制:

分別取A液25ul,B液25ul置于干凈試管中混勻,室溫放置2-5分鐘,加1ml蒸餾水,混勻,再加C液100ul待用。

*使用前,根據(jù)所需顯色劑用量,按照以上比例現(xiàn)配現(xiàn)用。

 

四:標本染色:

1. 充分干燥(室溫2小時以上或過夜)的細胞涂片先用記號筆在標本外畫圈,然后滴加固定液50μl,室溫靜置2-3分鐘,用PBS淋洗,擦干玻片背面及細胞外的PBS。

*以下反應(yīng)均需在濕盒中進行。

2. 分別滴加抗人CD3、CD4、CD8單抗適量(10-30μl),4℃過夜,PBS淋洗3次。

3. 滴加生物素標記抗小鼠IgG適量(10-30μl),37℃孵育30-45分鐘,PBS淋洗3次。

4. 滴加堿性磷酸酶標記鏈霉卵白素適量(10-30μl)37℃孵育30-45分鐘,PBS淋洗3次。

5. 滴加顯色劑30-50μl,室溫顯色20-40分鐘??稍陲@微鏡下觀察,待細胞膜上出現(xiàn)紅色標記物時,用PBS淋洗。

6. 滴加細胞核復染液30-50μl,30秒后自來水淋洗。

7. 滴加封片劑,蓋片封片,鏡檢。如不需保存亦可用水替代封片劑蓋片鏡檢。

 

五:觀察:

 

高倍鏡下選取染色好的視野記數(shù)100-200個單個核細胞,細胞表面有紅色標記物為陽性細胞。算出陽性率。

 

六:正常參考值:

 

正常人外周血中,陽性細胞百分率一般在:CD3,60-80%;CD4,35-55%;CD8,20-30%;CD4/CD8的比值在1.5-2.0范圍內(nèi)。

 

七:儲存條件及有效期:

 

2-8℃保存,禁止冷凍,有效期為12個月。有效期內(nèi)可在0-25℃范圍內(nèi)七天短時運輸。使用時應(yīng)及時及拿及用,使用后應(yīng)立即放回冰箱。生物試劑日期,使用期限或失效日期見標簽。

 

八:注意事項:

 

1. 免疫細胞化學檢測是一種包含多步驟的檢測方法,試劑的選擇、樣本的處理、涂片的制備、染色及其結(jié)果的判讀均需要進行專業(yè)的培訓。

2. 任何陽性或陰性的解讀,應(yīng)由病理科醫(yī)生結(jié)合病理形態(tài)學,研究表現(xiàn)及其它檢測方法進行,不作為單獨的診斷指標。

3. 復染過度或不足都可能影響結(jié)果的判讀。

4. 陰性結(jié)果表示未檢出抗原,不一定表示樣本中無該抗原存在,待測抗原編碼基因變異,抗原低表達或抗原修復不當?shù)?,都會造成抗原無法檢出。

5. 本試劑僅對經(jīng)處理的人外周血細胞進行驗證,不做其他用途

6. 試劑盒使用中,應(yīng)有適當?shù)姆雷o措施,以避免試劑同皮膚和眼睛接觸。

 

T細胞亞群試劑盒如何使用,操作過程詳解

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