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ELISA的由來(酶聯(lián)免疫的由來)

更新時(shí)間:2013-05-06      瀏覽次數(shù):3889

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

 
96-well的孔盤 96-well的孔盤

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (又稱酵素免疫分析法 ,Enzyme-linked immunosorbent assay,簡(jiǎn)稱ELISA )利用抗原 抗體之間專一性鍵結(jié)之特性,對(duì)檢體進(jìn)行檢測(cè);由於結(jié)合於固體承載物(一般為塑膠孔盤)上之抗原或抗體仍可具有免疫活性 ,因此設(shè)計(jì)其鍵結(jié)機(jī)制後,配合酵素呈色反應(yīng),即可顯示特定抗原或抗體是否存在,並可利用呈色之深淺進(jìn)行定量分析。 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (又稱酵素免疫分析法 ,Enzyme-linked immunosorbent assay,簡(jiǎn)稱ELISA )利用抗原 抗體之間專一性鍵結(jié)之特性,對(duì)檢體進(jìn)行檢測(cè);由于結(jié)合于固體承載物(一般為塑膠孔盤)上之抗原或抗體仍可具有免疫活性 ,因此設(shè)計(jì)其鍵結(jié)機(jī)制后,配合酵素呈色反應(yīng),即可顯示特定抗原或抗體是否存在,并可利用呈色之深淺進(jìn)行定量分析。 根據(jù)待測(cè)樣品與鍵結(jié)機(jī)制的不同,ELISA可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方式,主要以三明治法( sandwich )、間接法( indirect )、以及競(jìng)爭(zhēng)法( Competitive )三種為主,以下為各種方法之介紹。根據(jù)待測(cè)樣品與鍵結(jié)機(jī)制的不同,ELISA可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方式,主要以三明治法( sandwich )、間接法( indirect )、以及競(jìng)爭(zhēng)法( Competitive )三種為主,以下為各種方法之介紹。

三明治法

三明治法常用於檢測(cè)大分子抗原,一般之操作步驟為:三明治法常用于檢測(cè)大分子抗原,一般之操作步驟為:

  1. 將具有專一性之抗體固著( coating )於塑膠孔盤上,完成後洗去多餘抗體將具有專一性之抗體固著( coating )于塑膠孔盤上,完成后洗去多余抗體
  2. 加入待測(cè)檢體,檢體中若含有待測(cè)之抗原,則其會(huì)與塑膠孔盤上的抗體進(jìn)行專一性鍵結(jié)加入待測(cè)檢體,檢體中若含有待測(cè)之抗原,則其會(huì)與塑膠孔盤上的抗體進(jìn)行專一性鍵結(jié)
  3. 洗去多餘待測(cè)檢體,加入另一種對(duì)抗原專一之一次抗體,與待測(cè)抗原進(jìn)行鍵結(jié)洗去多余待測(cè)檢體,加入另一種對(duì)抗原專一之一次抗體,與待測(cè)抗原進(jìn)行鍵結(jié)
  4. 洗去多餘未鍵結(jié)一次抗體,加入帶有酵素之二次抗體,與一次抗體鍵結(jié)洗去多余未鍵結(jié)一次抗體,加入帶有酵素之二次抗體,與一次抗體鍵結(jié)
  5. 洗去多餘未鍵結(jié)二次抗體,加入酵素受質(zhì)使酵素呈色,以肉眼或儀器讀取呈色結(jié)果洗去多余未鍵結(jié)二次抗體,加入酵素受質(zhì)使酵素呈色,以肉眼或儀器讀取呈色結(jié)果

三明治法分別以兩種抗體對(duì)檢體中的抗原進(jìn)行兩次專一性辨認(rèn),因此專一性相當(dāng)高,但此待測(cè)抗原必須是多價(jià)抗原,如此才可獲得兩種以上的專一性抗體,以分別進(jìn)行夾心;而且此法需要足夠的表位空間以進(jìn)行抗原抗體的夾心,所以並不適用於半抗原或小分子抗原等分子量較小之標(biāo)的。三明治法分別以兩種抗體對(duì)檢體中的抗原進(jìn)行兩次專一性辨認(rèn),因此專一性相當(dāng)高,但此待測(cè)抗原必須是多價(jià)抗原,如此才可獲得兩種以上的專一性抗體,以分別進(jìn)行夾心;而且此法需要足夠的表位空間以進(jìn)行抗原抗體的夾心,所以并不適用于半抗原或小分子抗原等分子量較小之標(biāo)的。

間接法

間接法常用於檢測(cè)抗體,一般之操作步驟為:間接法常用于檢測(cè)抗體,一般之操作步驟為:

  1. 將已知之抗原固著於塑膠孔盤上,完成後洗去多餘之抗原將已知之抗原固著于塑膠孔盤上,完成后洗去多余之抗原
  2. 加入待測(cè)檢體,檢體中若含有待測(cè)之一次抗體,則其會(huì)與塑膠孔盤上的抗原進(jìn)行專一性鍵結(jié)加入待測(cè)檢體,檢體中若含有待測(cè)之一次抗體,則其會(huì)與塑膠孔盤上的抗原進(jìn)行專一性鍵結(jié)
  3. 洗去多餘待測(cè)檢體,加入帶有酵素之二次抗體,與待測(cè)之一次抗體鍵結(jié)洗去多余待測(cè)檢體,加入帶有酵素之二次抗體,與待測(cè)之一次抗體鍵結(jié)
  4. 洗去多餘未鍵結(jié)二次抗體,加入酵素受質(zhì)使酵素呈色,藉儀器(ELISA reader)測(cè)定塑膠盤中的吸光值(OD值),以評(píng)估有色終產(chǎn)物的含量即可測(cè)量待測(cè)抗原的含量。洗去多余未鍵結(jié)二次抗體,加入酵素受質(zhì)使酵素呈色,借儀器(ELISA reader)測(cè)定塑膠盤中的吸光值(OD值),以評(píng)估有色終產(chǎn)物的含量即可測(cè)量待測(cè)抗原的含量。

競(jìng)爭(zhēng)法

競(jìng)爭(zhēng)法是一種較少用到的ELISA檢測(cè)機(jī)制,一般用於檢測(cè)小分子抗原,其操作步驟為:競(jìng)爭(zhēng)法是一種較少用到的ELISA檢測(cè)機(jī)制,一般用于檢測(cè)小分子抗原,其操作步驟為:

  1. 將具有專一性之抗體固著於塑膠孔盤上,完成後洗去多餘抗體將具有專一性之抗體固著于塑膠孔盤上,完成后洗去多余抗體
  2. 加入待測(cè)檢體,使檢體中的待測(cè)抗原與塑膠孔盤上的抗體進(jìn)行專一性鍵結(jié)加入待測(cè)檢體,使檢體中的待測(cè)抗原與塑膠孔盤上的抗體進(jìn)行專一性鍵結(jié)
  3. 加入帶有酵素之抗原,此抗原也可與塑膠孔盤上的抗體進(jìn)行專一性鍵結(jié),由於塑膠孔盤上固著的抗體數(shù)量有限,因此當(dāng)檢體中抗原的量越多,則帶有酵素之抗原可鍵結(jié)的固著抗體就越少,亦即,兩種抗原皆競(jìng)相與塑膠孔盤上抗體鍵結(jié),即所謂競(jìng)爭(zhēng)法之由來。加入帶有酵素之抗原,此抗原也可與塑膠孔盤上的抗體進(jìn)行專一性鍵結(jié),由于塑膠孔盤上固著的抗體數(shù)量有限,因此當(dāng)檢體中抗原的量越多,則帶有酵素之抗原可鍵結(jié)的固著抗體就越少,亦即,兩種抗原皆競(jìng)相與塑膠孔盤上抗體鍵結(jié),即所謂競(jìng)爭(zhēng)法之由來。
  4. 洗去檢體與帶有酵素之抗原,加入酵素受質(zhì)使酵素呈色,當(dāng)檢體中抗原量越多,代表塑膠孔盤內(nèi)留下之帶有酵素的抗原越少,顯色也就越淺。洗去檢體與帶有酵素之抗原,加入酵素受質(zhì)使酵素呈色,當(dāng)檢體中抗原量越多,代表塑膠孔盤內(nèi)留下之帶有酵素的抗原越少,顯色也就越淺。

當(dāng)需要偵測(cè)無法獲得兩種以上單一性抗體的抗原,或是不易得到足夠的純化抗體以固著於孔盤上時(shí),一般會(huì)考慮使用競(jìng)爭(zhēng)法ELISA。當(dāng)需要偵測(cè)無法獲得兩種以上單一性抗體的抗原,或是不易得到足夠的純化抗體以固著于孔盤上時(shí),一般會(huì)考慮使用競(jìng)爭(zhēng)法ELISA。

 

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