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上海信帆生物:怎樣解決RNAi的脫靶問題

更新時間:2016-05-17      瀏覽次數(shù):2015

生物通報道:在使用殺傷性武器的時候,不傷及無辜很重要,對于RNA干涉(RNAi)來說也是如此。RNAi是一種常用的基因失活工具,它的主要缺陷在于會引起序列特異性的脫靶效應(yīng)。這樣的脫靶效應(yīng)很難預(yù)測,因為siRNA能夠影響與它部分互補的序列,像miRNA那樣抑制基因的表達。

要減少脫靶效應(yīng),可以將針對同一mRNA的不同siRNA混合起來使用。這些siRNA作用于同一個目標(biāo),每種siRNA的濃度得以降低,稀釋了各自的脫靶效應(yīng)。然而,這一策略在實際操作中面臨著兩個問題。其一,目前“Smart pools”只包括四個合成的siRNA,復(fù)雜性還不足以顯著減少脫靶效應(yīng),而合成更多siRNA的成本又太高。其二,利用DicerRNase III消化dsRNA時,siRNA混合物中會出現(xiàn)長度各異的剪切產(chǎn)物,進而引發(fā)許多問題。

日前,Regensburg大學(xué)的Gunter Meister領(lǐng)導(dǎo)研究團隊在Nucleic Acids Research雜志上發(fā)表文章,描述了一種能克服上述問題的新方法。這種被稱為siPools的低成本方法,能夠簡單而的生成含有多達60siRNA的混合物,將脫靶效應(yīng)降低到檢出限以下。

據(jù)介紹,siPools的關(guān)鍵一步是,設(shè)計針對同一個基因的幾十種siRNA,并將這些序列結(jié)合到一個DNA模板上,不同siRNA序列之間以短序列相連。這些模板經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、退火和酶切就能生成成分明確的siRNA混合物。

為了驗證siPools的效果,研究人員選擇人類基因POLGSCYL1作為RNAi的靶標(biāo)。之前有研究顯示,針對這兩個基因的siRNA很容易影響到MAD2基因的表達,因此它們可以作為檢測脫靶效應(yīng)的理想對象。

研究人員針對這兩個基因,分別設(shè)計了含有60siRNAsiPools,然后用它們轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。研究顯示,在濃度相同的情況下,siPools敲低目標(biāo)基因與單個siRNA一樣有效。

這兩個siPools都含有一個MAD2脫靶效應(yīng)很強的siRNA。然而在轉(zhuǎn)染之后,MAD2上并未發(fā)生可檢測到的脫靶影響。研究人員隨后又通過螢光素酶報告基因證實了這一點。

此外,研究人員還進行了全轉(zhuǎn)錄組的芯片分析。他們發(fā)現(xiàn),單個脫靶siRNA除了MAD2以外還大大減少了許多其他的轉(zhuǎn)錄本,但siPoolsMAD2和總體轉(zhuǎn)錄本水平都沒有影響。這說明,將大量siRNA混合起來的確能夠大大降低RNAi的脫靶效應(yīng)。下一步,Meister將進一步評估siPools在活體內(nèi)作用效果。

值得注意的是,Meister等人還將siPools成功用于長非編碼RNAlncRNA)。單個siRNA往往難以對lncRNA施加影響,這可能是因為單個siRNA難以接觸到高度結(jié)構(gòu)性的lncRNA分子?,F(xiàn)在,研究團隊正在構(gòu)建針對lncRNAsiPool文庫。

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