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WB實(shí)驗(yàn)代測實(shí)驗(yàn)步驟

更新時(shí)間:2018-04-17      瀏覽次數(shù):1372
   WB實(shí)驗(yàn)代測實(shí)驗(yàn)步驟
  1.收集蛋白樣品(Protein sample preparation)
  可以使用適當(dāng)?shù)牧呀庖?,例如Western及IP細(xì)胞裂解液、RIPA裂解液等,裂解貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品。對(duì)于某些特定的亞細(xì)胞組份蛋白,例如細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋白等,可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組份蛋白,也可以使用試劑盒進(jìn)行抽提,例如細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒
  收集完蛋白樣品后,為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致,需要測定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同,需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y定方法。因?yàn)椴煌牡鞍诐舛葴y定方法對(duì)于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。
  2.電泳(Electrophoresis)
  (1)SDS-PAGE凝膠配制
  SDS-PAGE凝膠可以參考一些文獻(xiàn)資料進(jìn)行配制
  (2)樣品處理
  在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積,在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品。5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關(guān)文獻(xiàn)資料配制
  (3)上樣與電泳
  冷卻到室溫后,把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。
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