什么是細(xì)菌內(nèi)毒素?
細(xì)菌內(nèi)毒素(脂多糖,LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分。人們?cè)谘芯扛锾m氏陰性菌血癥和內(nèi)毒素血癥的過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)細(xì)菌內(nèi)毒素在其中起著關(guān)鍵的作用,內(nèi)毒素使機(jī)體免疫功能?chē)?yán)重受損,進(jìn)一步的發(fā)展可能引發(fā)膿毒性休克,彌散性血管內(nèi)凝血,急性呼吸窘迫綜合癥,全身炎癥反應(yīng)綜合癥或致命性多器官功能衰竭。因此,內(nèi)毒素的去除對(duì)于人類(lèi)疾病治療的注射型藥品、生物制品等都是必須的,尤其對(duì)于基因藥物、蛋白藥物、單抗克隆藥物、生物疫苗、小分子化學(xué)藥物等生物制品的下游純化處理來(lái)說(shuō)就顯得非常重要。
細(xì)菌內(nèi)毒素具有很強(qiáng)的耐熱性和化學(xué)穩(wěn)定性,100℃以下無(wú)大變化,在120℃高溫下加熱4小時(shí)僅能破壞98%,要*滅活需在180℃高溫下,加熱2小時(shí)以上,這樣的方法進(jìn)行內(nèi)毒素去除有相當(dāng)難度。一般化學(xué)藥品不影響細(xì)菌內(nèi)毒素的活性,只有強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或強(qiáng)氧化劑可以破壞細(xì)菌內(nèi)毒素。
內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒細(xì)菌內(nèi)毒素去除的原理
因細(xì)菌內(nèi)毒素體積小,耐熱性及化學(xué)穩(wěn)定性強(qiáng),所以一般的過(guò)濾、加熱和化學(xué)方法不易去除或滅活內(nèi)毒素?,F(xiàn)比較常用的內(nèi)毒素去除方法多為超濾法或親和層析法。本試劑盒使用的是一類(lèi)內(nèi)毒素去除樹(shù)脂,它以生物安全性*的內(nèi)毒素特異吸附物質(zhì)為配體,經(jīng)此親和樹(shù)脂純化,樣品終的內(nèi)毒素水平可低于0.1 EU/ml。而且經(jīng)過(guò)親和純化后沒(méi)有對(duì)人體有毒有害物質(zhì)殘余,適合抗體、疫苗等生物制品的內(nèi)毒素去除。
內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒內(nèi)毒素去除實(shí)驗(yàn)操作
親和層析內(nèi)毒素去除的方法操作較簡(jiǎn)單,具體操作如下:
樣品處理:樣品在上樣前建議離心或用0.22μm或0.45μm濾膜過(guò)濾,減少雜質(zhì),提高蛋白純化效率和防止堵塞柱子。樣品PH好控制在7-8,是內(nèi)毒素結(jié)合至柱子上佳pH條件。樣品好控制適當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度,減少非特異性吸附,如0.15-0.5M的NaCl。
活化樹(shù)脂:將預(yù)裝柱置于鐵架臺(tái),垂直固定,去除預(yù)裝柱頂部的蓋子,打開(kāi)流速控制器,使保護(hù)液在重力作用下流干,加入5ml再生緩沖液(預(yù)冷),調(diào)節(jié)流速控制器,保持流速在0.25ml/min(或者1滴/6s),待再生緩沖液流干,再加入5ml再生緩沖液(預(yù)冷),再重復(fù)操作兩次,確保體系保持無(wú)熱原存在。即使是次使用也必須進(jìn)行這一步操作。這步操作大約需要60分鐘完成。
平衡樹(shù)脂:活化完畢,加入6ml平衡緩沖液(預(yù)冷),沿柱管內(nèi)壁均勻加入其中,保證清洗柱管的內(nèi)壁,調(diào)節(jié)流速控制器,保持流速在0.5ml/min(或者1滴/3s),流干平衡緩沖液,再按此操作重復(fù)兩次。這步操作大約需要40分鐘完成。
內(nèi)毒素去除:2ml樣品加到平衡后的層析柱中,調(diào)節(jié)流速在0.25ml/min(或者1滴/6s),不接收流出液。當(dāng)樣品流完,繼續(xù)添加樣品,樣品可以加滿柱管,同時(shí)收集流出液,即為除熱原的樣品。為了降低樣品的損失,樣品流完后,再添加2ml平衡液,并與之前的流出液合并。檢測(cè)樣品濃度及內(nèi)毒素水平。
再次使用:如果流出樣品內(nèi)毒素水平未能達(dá)到預(yù)期值,需要將預(yù)裝柱按照步驟2、3重新再生、平衡,然后上樣純化。
保存條件:如果預(yù)裝柱用完后需要保存,先用10ml平衡緩沖液(預(yù)冷)平衡柱子,待平衡液流干,加入10ml 20%乙醇溶液并于4℃保存。
內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒內(nèi)毒素去除親和填料的注意事項(xiàng):
1、內(nèi)毒素去除用的親和填料每次使用前都需用再生液和平衡液處理;
2、實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的相關(guān)溶液和器具均要除熱原,防止引入內(nèi)毒素污染;
3、適當(dāng)延長(zhǎng)填料與樣品溶液的處理時(shí)間可以加大內(nèi)毒素的吸附量;
4、樣品如果本身是帶負(fù)性電荷,為增加樣品回收率,樣品中可以加0.2M NaCl;
5、樣品pH在7-8范圍內(nèi),可以提高內(nèi)毒素去除效率同時(shí)減少非特異性吸附;
6、樣品內(nèi)毒素如果一次去除不*,可以重復(fù),直到合格為止;
7、親和填料保存條件為20%乙醇,4~8℃。