講解熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)方法

更新時(shí)間：2017-12-12

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　　講解熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)方法

　　熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)方法：

　　1．取增菌液1ml加到1.5ml無(wú)菌離心管中，10,pm離心5min，棄去上清；加入50ul DNA提取液，充分混勻后沸水浴5 min，

　　13,pm離心5min，取上清液進(jìn)行檢測(cè)或保存于-20℃以待檢測(cè)。

　　2．將PCR反應(yīng)液置室溫平衡，融化后取Taq酶,按管加入Taq酶，即每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制為：PCR反應(yīng)液22.5ul+0.4ul

　　Taq酶。

　　3．加入模板：將保存在-20℃的核酸提取物置室溫解凍，以13,pm離心5min。陰、陽(yáng)性對(duì)照使用前置室溫解凍。在每個(gè)

　　PCR反應(yīng)管中分別加入步驟1中處理過(guò)的模板或陰、陽(yáng)性對(duì)照各2ul，蓋好管蓋，置于PCR儀上，記錄相應(yīng)樣品號(hào)。

　　4．上機(jī)擴(kuò)增、檢測(cè)區(qū)：反應(yīng)條件為95℃：3min，1個(gè)循環(huán)；95℃：5sec，60℃：40sec（信號(hào)采集），40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系設(shè)為25ul。對(duì)于多通道熒光PCR儀，信號(hào)采集時(shí)設(shè)定為Fam熒光素。

　　試劑盒中含有沙門氏菌特異的引物，當(dāng)樣品中含有沙門氏菌時(shí)，前增菌后提取的沙門氏菌DNA通過(guò)PCR成指數(shù)擴(kuò)增，在反應(yīng)過(guò)程中沙門氏菌特異的熒光探針跟靶核酸雜交,同時(shí)被Taq酶水解,把探針上的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分開(kāi),從而通過(guò)熒光增量來(lái)實(shí)時(shí)判斷沙門氏菌的存在。

　　試劑盒的保存條件及有效期

1．本試劑盒于-20℃保存。2．有效期為6個(gè)月。

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