瓊脂糖-易洗脫重組鏈球菌蛋白G親和填料

1 、產(chǎn)品介紹

ee-ProGNUPharose FF是一款易洗脫的抗體親和填料，ee為Easy Elution的縮寫(xiě)，意味該填料較傳統(tǒng)的蛋白G填料更容易洗脫，即洗脫的pH更高，FF為Fast Flow的縮寫(xiě)，意味該填料可在高流速下工作。

易洗脫重組鏈球菌蛋白G配基由大腸桿菌表達(dá)，不含動(dòng)物來(lái)源。ee-ProGNUPharose FF的基球與配基通過(guò)單點(diǎn)偶聯(lián)而成，加之對(duì)結(jié)合域的基因工程改造，其對(duì)h-IgG的動(dòng)態(tài)結(jié)合載量高于40mg/mL，pH=4~5的條件可以將h-IgG較好的洗脫，較市面的蛋白G填料產(chǎn)品有載量高和易洗脫兩大優(yōu)勢(shì)。與蛋白A填料相比，蛋白G填料的優(yōu)勢(shì)在于可以與人類和小鼠所有IgG亞型結(jié)合。本產(chǎn)品對(duì)人、小鼠、大鼠、兔、牛等等來(lái)源的多種類 型和亞型的抗體有親和作用，可從腹水、血清、細(xì)胞培養(yǎng)上清或細(xì)胞抽提物中分離和純化多種哺乳動(dòng)物不同亞型的抗體或包含抗體Fc片段的基因工程重組蛋白，可滿足不同規(guī)模的研究或生產(chǎn)需求。

2 、產(chǎn)品特點(diǎn)與技術(shù)指標(biāo)

注：a90%體積以上的微球在此粒徑范圍；bDBC10%測(cè)試條件為：10%流穿，6 min 停留時(shí)間；c 推薦流速是指該流速可滿足大部分柱高下2~6 min停留時(shí)間的使用條件，并非只能在該流速范圍內(nèi)工作；d 10 cm 柱高下的最大測(cè)試流速。

3、抗體親和層析簡(jiǎn)介——易洗脫重組鏈球菌蛋白 G

ee-ProG NUPharose FF 的配基為重組鏈球菌蛋白G，與金黃色-葡萄球菌蛋白A一樣，其與IgG之間的親和作用也主要通過(guò)蛋白G結(jié)合域與Fc區(qū)之間的相互作用。在基因工程改造過(guò)程中，將鏈球菌蛋白G的白蛋白結(jié)合域去除，使得該配基與目標(biāo)分子的特異性結(jié)合增強(qiáng)。野生型蛋白G的不同結(jié)合域?qū)?/span>IgG的親和力不同，本產(chǎn)品的配基選取了親和力較弱的結(jié)合域并對(duì)之加以基因工程改造，達(dá)到了易洗脫的目的。蛋白A與IgG之間的親和作用包括在IgG生理?xiàng)l件的溶液狀態(tài)下的疏水相互作用、極性相互作用和氫鍵，蛋白G與IgG之間的親和作用是以疏水相互作用為主。一般需要降低pH將親和作用破壞后進(jìn)行洗脫，例如pH=3的甘-氨酸、檸檬酸鹽和乙酸鹽等。對(duì)于本產(chǎn)品，pH=4~5的條件可以將IgG較好的洗脫，比市面上常見(jiàn)的蛋白G填料的洗脫pH高1個(gè)單位左右。下表為蛋白A和蛋白G對(duì)不同哺乳動(dòng)物不同亞型抗體的結(jié)合情況。注：-表示不結(jié)合；+表示微弱結(jié)合；++表示中等結(jié)合4.5 在位清洗（CIP）

若發(fā)生柱；+++表示很強(qiáng)結(jié)合。

4 、使用方法參考 

4.1  色譜柱裝填

以下闡述與層析系統(tǒng)連接時(shí)，填料的色譜柱裝填方法。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣，液體最好做脫氣處理。

（2）填料用量計(jì)算：通過(guò)沉降定量填料體積，需要的沉降填料體積=柱體積×壓縮 比（也稱壓縮因子）。沉降體積是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩(wěn)定體積。ee-ProGNUPharose FF的壓縮比為1.15。為使達(dá)到裝柱比，可通過(guò)柱頭下壓的方法，也可以通過(guò)高流速壓柱。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻后量取相應(yīng)體積，抽濾除去液體，并用約3倍填料體積的純化水洗滌，重復(fù)3次，以除去保存液。

（4）裝柱填料懸液準(zhǔn)備：將填料轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦?，加入適量的裝柱液，制成50~75 v%的裝柱填料懸液，使用前攪勻。

（5）裝填前準(zhǔn)備：在清洗干凈的層析柱下端加入裝柱液，以除去下墊片及層析柱下端的空氣，在柱內(nèi)保留少量的蒸餾水，擰緊下堵頭，調(diào)整柱子使其垂直于地面。

（6）裝填：將攪勻后的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內(nèi)（必要時(shí)使用裝柱器），為避免引入氣泡，應(yīng)使之沿層析柱內(nèi)壁自然流下。將所有填料加入后，用裝柱液將裝柱器加滿，擰緊裝柱器上蓋，將柱子與層析系統(tǒng)連接。

（7）壓柱：使柱內(nèi)填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降），待填料沉降完-全后（填料與液體的界面清晰），去除裝柱器，裝上上柱頭，并將柱頭下降至界面處；通過(guò)高流速（推薦流速見(jiàn)下表，注意柱壓不超過(guò)0.3MPa），繼續(xù)壓柱至界面清晰穩(wěn)定，標(biāo)記界面穩(wěn)定時(shí)的柱高。停泵，打開(kāi)柱頭上的閥門(mén)/堵頭，關(guān)閉柱底的閥門(mén)/堵頭，下壓柱頭至標(biāo)記位置下方與壓縮比對(duì)應(yīng)的位置，旋緊柱頭，裝柱完成。裝柱完成后，需用高流速平衡柱內(nèi)的填料。

4.2 柱效測(cè)定和評(píng)價(jià)

完成裝柱后、使用前可通過(guò)柱效測(cè)定和評(píng)價(jià)可以確認(rèn)層析柱裝填質(zhì)量。柱效通常用理論塔板高度（HETP）和非對(duì)稱因子（As）來(lái)評(píng)價(jià)。

柱效測(cè)定可以采用丙酮或者NaCl作為樣品進(jìn)行，按照下表配制樣品溶液和流動(dòng)相。 

根據(jù)UV或者電導(dǎo)率曲線計(jì)算理論塔板高度（HETP）、理論塔板數(shù)（N）和非對(duì)稱因子（As），公式如下：

HETP=L/N

N=5.54(VR/Wh)2 As=a/b

其中：L為柱高；VR為保留體積；Wh 為半高峰寬；a為在10%峰高處的第一個(gè)半峰寬；b為在10%峰高處的第二個(gè)半峰寬。

一般來(lái)說(shuō)，HETP的數(shù)值應(yīng)小于填料平均粒徑的三倍（即HETP/D50<3，D50為填 料的平均粒徑），As應(yīng)在0.8~1.5之間。

4.3 平衡與上樣（Equilibration & Loading）

PB緩沖液（20mM PB+150 mM NaCl，pH=7.0~7.4）是較為常用和通用的緩沖體系。初始的緩沖液稱為平衡緩沖液，記為緩沖液A。有時(shí)也選擇不添加NaCl。

在上樣前，需用緩沖液A在操作流速下平衡層析柱，該過(guò)程通常需要5~10個(gè)柱體積的緩沖液A，以電導(dǎo)、pH 等檢測(cè)信號(hào)參數(shù)不變且與緩沖液A對(duì)應(yīng)為準(zhǔn)。

上樣量可按“mg目標(biāo)蛋白/mL填料"來(lái)設(shè)定，通常為DBC10%的50~80%，例如ee-ProGNUPharoseFF產(chǎn)品對(duì)人IgG的DBC10%為~40mg/mL上樣量可控制為20~32 mg/mL。在條件篩選階段，也可以降低上樣品，觀察結(jié)合、特異性和洗脫情況。上樣前需要對(duì)樣品進(jìn)行離心（10000 g以上）、過(guò)濾（0.22或0.45μm）處理，以免堵塞色譜柱。

上樣后需要3~10個(gè)柱體積的緩沖液A再平衡層析柱。

4.4 洗脫與再生（Elution & Regeneration）

一般的蛋白G填料，最-常用的洗脫方式為pH=3的甘-氨酸、檸檬酸鹽或乙酸鹽，蛋白G與一些IgG之間的結(jié)合力更強(qiáng)，有時(shí)需要將pH降低至2.5才能完-全洗脫。但該pH較低，可能會(huì)使一些抗體失活或聚集。本產(chǎn)品通常在pH=4~5時(shí)，IgG可被較好洗脫。

于不同類型的IgG，最高的洗脫pH會(huì)有差異。倘若pH=4~5對(duì)IgG仍太低，也可以將洗脫液收集在弱堿性的緩沖液中，中和至中性，以縮短低pH條件的接觸時(shí)間。洗脫之后，可用5~10個(gè)柱體積的洗脫液對(duì)色譜柱進(jìn)行再生。

4.5  在位清洗（CIP）

若發(fā)生柱壓升高，或有蛋白與填料強(qiáng)烈結(jié)合無(wú)法洗脫，或有沉淀、變性蛋白時(shí)，需要對(duì)填料進(jìn)行在位清洗，可采用以下方法去除雜質(zhì)，反向清洗效果更佳。

4.6 填料保存

填料的初始保存液為20%乙醇，使用過(guò)后可繼續(xù)用20%乙醇保存。保存溫度在2~8℃為宜，不可凍存。